La listèria monocitògena (Listeria monocytogenes) és un bacteri firmicut estès a tota mena d'ambients (sòl, aigües o microbiota fecal de diversos mamífers)[1] com a sapròfit, però també és capaç de fer la transició a patogen intracel·lular quan és ingerit per humans i animals, jugant un paper com a patogen oportunista.[2]
És l'agent causant de la listeriosi i es considera un dels patògens d'origen alimentari més virulents, amb una letalitat del 20-30%.[3] Responsable d'aproximadament 2.500 casos i 500 morts registrats cada any als Estats Units, la listeriosi és la primera causa de mort entre els patògens dels aliments, superant fins i tot salmonel·la i botulisme.[4][5]
L. monocytogenes és un bacteri grampositiu, de forma bacil·lar, no formador d'espores, catalasa positiu, oxidasa negatiu, anaerobi facultatiu i productor d'una β-hemolisina (degradació total de l'Agar sang). Quan l'organisme creix entre 20-25ºC produeix i assembla flagels a la superfície cel·lular, en canvi a 37ºC la producció baixa notablement.[6]
L. monocytogenes fou descoberta al 1924 per E.G.D. Murray a Cambridge, gràcies a la mort de sis conills i cobais de laboratori que patien mononucleosis; la seva descripció no va ser publicada fins al 1926. Murray i colaboradors l'anomenaren de primera instància Bacterium monocytogenes,[7] però al 1927 Pirie va canviar el nom a Listerella hepatolytica.[6] Hi va haver una gran confusió sobre la nomenclatura del microorganisme fins al 1940 quan s'oficialitzà el nom actual a la 6a edició de Bergey Manual of Determinative Bacteriology.[8]
Tot i que les descripcions clíniques del patogen, tant en humans com en animals, es varen començar a fer durant els anys 20, no va ser reconegut com a causant de meningitis, sèpsis i infeccions neonatals fins al 1952 a Alemania.[9] Al 1966 Gray i Killinger van fer la primera publicació oficial sobre L. monocytogenes i les seves diferents infeccions en humans o animals.[6]
A començaments del 1980 es reconeix, finalment, la transmissió a través dels aliments de L. monocytogenes, a més a més durant tota la dècada s'observa un augment de casos reportats de listeriosis. Com els brots epidèmics de 1983 i 1985 a Canadà i California respectivament, que varen acabar de confirmar el paper dels aliments per la dissiminació del patogen.[1] Des de llavors el bacteri s'ha vist com l'agent causant de diferents brots alimentaris arreu d'Amèrica del Nord i Europa.[6]
Al 2001 es creà "The Canadian Listeriosis Reference Service" per la investigació de brots i desenvolupar una base de dades molecualr d'aïllats de L. monocytogenes.[8]
Gràcies a mètodes moleculars, el total de 214 soques aïllades fins al moment s'han pogut distribuir en 4 llinatges diferents (I, II, III i IV). Inicialment, al 1989, van ser descoberts els dos primers, però subseqüentment es van afegir els dos últims.[10][11]
Analitzant el serotip de les soques de L. monocytogenes, basat en antigens cel·lulars (O) i antigens flagel·lars (H),[12] s'han pogut diferenciar, al menys, 13 serotips que es poden subdividir en els llinatges:[11]
L. monocytogenes és un bacteri present en tota mena d'ambients; des del tracte intestinal d'una gran varietat de mamífers (inclosos els humans), superfícies de vegetals, una gran varietat de sòls, aigües, aliments, indústries, entre d'altres. Els indicis ecològics apunten a que es tractaria d'un bacteri sapròfit amb la capacitat de sobreviure i replicar-se en protozous que la depreden, una estratègia que segueixen altres tipus de microorganismes.[13][14]
No obstant, el seu paper en la majoria d'aquests ambients no està ben caracteritzat i en molts casos se'n troben solament formes vegetatives a l'espera de que les condicions siguin òptimes pel seu creixement.[13]
La seva gran diversitat de soques dificulta molt la tasca d'estudiar la seva biologia i ecologia, doncs les condicions de creixement, ambients en els que persisteix, capacitat de formar biofilms, entre d'altres; varien molt en funció de la soca.[15]
Kadam et al. (2013) van demostrar que un gran nombre de soques de L. monocytogenes són formadores de biofilms amb una elevada diversitat, depenent de la composició del medi (tipus de superfície) i la temperatura. Hi ha soques capaces d'adherir-se a l'acer inoxidable, al vidre o a superfícies de la indústria alimentària.[13] Tot i això, manquen evidències que confirmin la formació per part de L. monocytogenes de biofilms veritables: múltiples cèl·lules i polímers extracel·lulars que aporten protecció e interacció entre cèl·lules.[13] Degut a això L. monocytogenes és considerat un microorganisme pobre com a formador de biofilms i qüasi sempre es parla de biofilms mixtes formats a partir de la interacció entre diferents espècies bacterianes ("dual-species").[15]
La formació de biofilms acostuma a estar lligada a l'obtenció de resistències a antimicrobians, però en aquest cas la biomassa viable que forma el biofilm no presenta cap dificultat a l'hora de ser eliminada d'un punt de contaminació.[15]
En anglès "Long-Term survival phase", consisteix en una sèrie de canvis bioquímics i morfològics a nivell cel·lular, que són deguts a una variació del patró d'expressió genètica, i que porten al bacteri a un estat de letàrgia. Això li permet aturar el seu cicle biològic i perdurar durant llargs períodes de temps a l'espera de que les condicions de creixement tornin a ser favorables. Un canvi estructural del bacteri, clarament apreciable, és la transició de morfologia bacil·lar flagel·lada típica de L. monocytogenes a una morfologia cocal sense flagels.[13]
Se'n desconeix els mecanismes biològics subjacents, però s'ha comprovat que aquest estat li permet tolerar major condicions d'estrès, com podrien ser-ho; elevada temperatura i pressió, i exposició a agents antimicrobians com antibiòtics. Es creu que fins i tot podria resistir processos de neteja i desinfecció usats en la indústria alimentària, fet que justificaria la seva persistència en aquests ambients que, suposadament, no ofereixen les condicions necessàries per al seu creixement.[13]
Molts tipus de vertebrats homeoterms han provat ser reservoris de L. monocytogenes. Entre ells; molts animals de granja i humans portadors asimptomàtics. Diversos estudis in vitro confirmen que diferents espècies de nemàtodes bacteriofàgics i alguns artròpodes presenten el bacteri viu al tracte digestiu i també als excrements, cosa que posa aquestes espècies en el punt de mira com a possibles vectors i/o reservoris del patogen.[5][15]
De forma similar a altres bacteris com Legionella pneumophila, altres espècies del gènere Listeria o, fins i tot, algunes espècies del gènere Mycobacterium, L. monocytogenes presenta la capacitat de sobreviure a la fagocitosi per part de protists depredadors de bacteris, evitar la seva digestió i arribar a duplicar-se al seu interior. Aquesta estratègia justificaria la seva capacitat per esdevenir patògens ocasionals d'animals superiors, on trobem que molts mecanismes moleculars de fagocitosi per part de cèl·lules immunitàries fagocítiques són altament conservats al llarg de la filogènia dels eucariotes.[14][16]
Un altre fet de gran rellevància és la capacitat de molts protozous de formar quists de resistència, doncs podria ser una altre manera per part dels bacteris de sobreviure a condicions desfavorables. En un estudi realitzat amb una espècie no identificada de Acanthamoeba, es va veure que la majoria de la població del protozou s'enquistava en resposta a una elevada densitat intracel·lular de L. monocytogenes i, d'aquesta manera, aconseguia erradicar el bacteri i sobreviure a la seva infecció. En contraposició, altres estudis realitzats posteriorment amb Acanthamoeba castellanii i diversos patògens humans relacionats amb infeccions alimentàries, es va veure que L. monocytogenes resistia el procés d'enquistament i des-enquistament, permetent-li sobreviure a condicions desfavorables com la presència d'agents antibacterians durant llargs períodes de temps. En front les mateixes condicions, el bacteri presentava una pèrdua total de la viabilitat si no s'afegia el protozou al medi.[14][17]
Aquests fets posen de manifest el potencial que tenen els protozous com a vectors, reservoris i mecanisme de resistència en tota mena d'ambients, fins i tot en ambients antropogènics com indústries alimentàries, on quists d'Acanthamoeba castellanii han mostrat tindre una elevada prevalença.[14][17]
L. monocytogenes ha estat detectada en tota mena de sòls, destacant aquells que presenten elevada activitat hídrica, han estat recentment cultivats o són propers a pastures. A més grau d'humitat i contingut en matèria orgànica, més prolongada es veu la seva supervivència en aquest tipus d'ambients. En un estudi dut a terme a Alemanya; de 746 mostres de diferents sòls es van aïllar un total de 160 soques, i la incidència total de L. monocytogenes en les mostres va ser del 21.4%.[5][13]
Un altre factor de gran rellevància en la persistència i/o desenvolupament de L. monocytogenes en sòls, és el tipus de microbiota autòctona d'aquests ambients. S'ha comprovat que, en general, una pèrdua de diversitat i abundància d'altres microorganismes presents al sòl, facilita la implantació, supervivència i desenvolupament de L. monocytogenes. Això remarca la gran pressió que exerceix aquesta microbiota autòctona sobre aquest bacteri.[5]
En funció de la soca, les condicions de supervivència i creixement poden variar notablement, però un fet general que cal tindre en consideració és que L. monocytogenes presenta una gran capacitat d'adaptabilitat a condicions adverses. S'ha descrit que, quan aquestes canvien progressivament, el bacteri pot romandre en estat vegetatiu o amb cicles biològics extremadament lents en condicions molt desfavorables.[18][19]
Es podria establir que un límit aproximat d'acidesa per a la supervivència de L. monocytogenes seria de 3.35, però cal remarcar que dependrà de la resta de factors, la soca i la rapidesa amb la que canviï el pH del medi.[19]
Per tal d'eliminar els cations hidrogen que es generen com a conseqüència del pH àcid, aquest s'acoblen a la cadena de transport d'electrons i també s'exporten activament a l'exterior mitjançant ATPases que hidrolitzen ATP.[18]
S'expressen dos sistemes de regulació: Sistema de dos components lisR/lisK i Sistema glutamat descarboxilasa (GAD) que permeten augmentar el pH intracel·lular. El primer es un sistema on una cinasa d'histidina permet la detecció de les condicions àcides ambientals i una altra proteïna estableix una resposta a aquest estrès. El segon es troba compost per tres gens (gadA, gadB i gadC) que porten a terme la descarboxilació del glutamat produint la reacció: [18][20]
Segons un model matemàtic, s'estima que l'activitat hídrica mínima que permet creixement en L. monocytogenes és de 0.49, tot i que no ha estat confirmat per la dificultat que presenta fixar la resta de paràmetres que poden influir.[19]
Es sintetitzen proteïnes de xoc salí (Ssp) i proteïnes d'aclimatació a l'estrès (Sap) on trobem: GbuA, transportador osmoprotector de betaïna de glicina, i el gen ctc, relacionat amb la resistència a elevada osmolaritat en absència d'osmoprotectors com la betaïna de glicina. També es produeixen soluts compatibles.[18]
El factor sigma σB de la RNA polimerasa també té una funció important i trobem un sistema de dos components kdp relacionat amb la captació de l'ió potassi (K+) produint un efecte protector davant l'alt contingut de sal.[18]
Es tracta d'un bacteri resistent a la refrigeració, malgrat que ha mostrat ser sensible a una combinació d'altes concentracions de CO₂ i baixes temperatures. En condicions de laboratori algunes soques han arribat a presentar creixement fins als -0.5ºC, tot i que el més habitual és que les temperatures mínimes de creixement es trobin en el rang de 0.5 i 5 ºC en els diferents medis de cultiu, i entre 3 i 4ºC en aliments.[19] Val a dir que en condicions de pH àcid, salinitat elevada i/o de competència microbiana, (especialment de bacteris de l'àcid làctic) la temperatura mínima a la que pot créixer augmenta considerablement.[13][21]
Com adaptació a les temperatures baixes i per tal de mantenir la membrana cel·lular fluida es produeix un augment dels àcids grassos insaturats i un augment de la proporció d'àcids pentadecanoics (C15:0) respecte els àcids heptadecanoics (C17:0). A més a més es dóna un canvi en la forma de ramificació dels àcids grassos de iso-metil a anteiso-metil.[18] Paral·lelament es sintetitzen proteïnes com proteïnes de xoc fred (Csps), proteïnes d'aclimatació al fred (Caps) i proteases (GroEL, CIpP i CIpB) que degraden polipèptids anormals o nocius pel microorganisme. I també, soluts compatibles com betaïna de glicina i carnitina que actuen com a crioprotectors.[18]
En quant a l'expressió gènica, trobem que a baixes temperatures el factor sigma σB de la RNA polimerasa que es troba actiu en situacions d'estrès i està relacionat amb la síntesi de soluts compatibles.[18] D'altra banda l'expressió dels factors de virulència de Listeria monocytogenes també depèn de la temperatura, i es dóna a 37ºC.[13]
El procés infectiu del bacteri comprèn diverses etapes:
La listeriosi humana és una infecció causada per L. monocytogenes que es transmet principalment a través del consum d'aliments contaminats per aquest bacteri.[25] Els primers casos de listeriosi humana van ser descrits l'any 1929 per A. Nyfeldt a partir de pacients amb septicèmia generalitzada.[8]
L. monocytogenes afecta amb més freqüència a determinats grups de persones: ancians, individus immunocompromesos i embarassades. Tot i això, també pot afectar persones fora d'aquests factors de risc. Pot donar-se de forma esporàdica o en forma de brots.[6][8]
La principal via de transmissió és a partir del consum d'aliments contaminats, com; carns (salsitxes, paté, pernil i pollastre), verdures, menjar precuinat amb peix o mol·luscs, llet no pasteuritzada, gelats i formatges. També existeixen altres formes de transmissió rarament vistes, com ara directament d'animals a humans, així com entre persones. En embarassades, la infecció es pot transmetre al fill a través de la placenta o bé durant el part si la vagina presenta el microorganisme.[25]
A partir de l'anàlisi de mostres fecals s'ha pogut establir que entre el 5% i el 10% de la població és portadora d'aquest bacteri (amb un augment considerable al personal de laboratori) i, en menor mesura, també n'hi ha que són portadors a la vagina.[8][25]
Anualment, la taxa d'incidència oscil·la entre 0,1 i 1 cas per cada 100.000 habitants. Es tracta d'una incidència baixa, tot i que recentment s'ha detectat que la seva taxa està en augment. Aquest increment es creu que no estaria relacionat amb factors geogràfics ni socioeconòmics, així com tampoc amb gènere, ètnia o serotips infecciosos; sinó amb una població més vella que presenta alguna condició que la predisposa i amb una major supervivència de la població malalta. S’ha hipotetitzat que la reducció de la concentració de sal fins un 20% en productes llestos pel consum seguint les recomanacions de les agències de seguretat alimentària l’any 2002 podria contribuir al creixement del microorganisme, si és que està present. Aquesta política s’hauria aplicat amb l’objectiu de prevenir malalties relacionades amb la hipertensió.[8][25]
Tanmateix, malgrat la baixa incidència, té una elevada fatalitat (o letalitat), entre un 20 i un 30%, tot i l'administració d'un tractament adequat i a temps. Donada la seva taxa de fatalitat, la listeriosi és, després de la salmonel·losi, la segona causa de mort relacionada amb una infecció que es transmet via aliments més freqüent a Europa i USA.[8]
La infecció per L. monocytogenes té un espectre simptomatològic.[8] En persones immunocompetents pot ser asimptomàtica o bé desenvolupar-se com una típica gastroenteritis febril autolimitada (infecció no invasiva),[25] mentre que en els individus que presenten algun dels factors de risc pot causar una infecció invasiva, que es pot manifestar de tres formes diferents:[8]
A Europa aproximadament el 10-20% dels casos clínics són associats a l'embaràs, però la gran majoria es donen en persones immunocompromeses no embarassades, sobretot en gent gran.[25]
D'altra banda, també pot causar una àmplia varietat d'infeccions localitzades, com ara conjuntivitis, peritonitis, osteomielitis, pericarditis, arteritis i fascitis necrosant, entre moltes altres.[25]
El període d'incubació, des de l'exposició (consum de l'aliment contaminat) fins a presentar símptomes, és variable segons el tipus d'infecció: en infeccions no invasives, entre 6 hores i 10 dies; en infeccions del torrent sanguini, entre 1 i 12 dies; en infeccions del sistema nerviós central, entre 1 i 14 dies; i en infeccions neonatals, entre 17 i 67 dies.[8]
El diagnòstic de la listeriosi és complicat degut al període d'incubació i a les múltiples manifestacions clíniques. A més, com que sovint els símptomes són compatibles amb els causats per altres malalties no se sospita aquesta possibilitat i, conseqüentment, hi ha un endarreriment en el seu diagnòstic que contribueix a la seva mortalitat.[8]
La seva identificació és duta a terme a través de tècniques microbiològiques estàndards. Es diagnostica a partir d'un cultiu positiu. És fàcilment cultivable a partir de mostres clíniques com són la sang (hemocultiu), el líquid cefaloraquidi, , el meconi, rentats gàstrics, el líquid amniòtic, els loquis o frotis de l'oïda de nadons. El cultiu de frotis vaginal o excrements (coprocultiu) no és d'utilitat degut a la figura del portador. Les mostres es cultiven en plaques d'agar sang i s'incuben durant 24-48 hores a 35ºC i una atmosfera ambiental. Si el bacteri hi és, creix formant colònies petites i rodones, beta hemolítiques. Cal establir un diagnòstic diferencial amb altres grampositius, com ara Streptococcus.[8][25] Patir listeriosi durant l'embaràs té conseqüències greus i és difícil de diagnosticar, de manera que caldria fer cultius de qualsevol embarassada amb febre i símptomes gastrointestinals.[25]
La PCR és l'única tècnica de detecció ràpida utilitzada en mostres clíniques. És particularment útil quan és probable que l'administració antibiòtica prèvia hagi compromès el cultiu. Les proves serològiques no són de caràcter diagnòstic donada la reactivitat antigènica creuada entre L. monocytogenes i altres bacteris grampositius com Staphylococcus, Enterococcus i espècies de Bacillus.[25]
És molt important iniciar el tractament tan aviat com es detecti la infecció, especialment en els casos de bacterièmia. El tractament antibiòtic consisteix en un beta-lactàmic, normalment penicil·lina o ampicil·lina, sol o en combinació amb gentamicina (aminoglicòsid). No s’ha demostrat que l’addició de gentamicina suposi un avantatge, ja que l’efecte sinèrgic només s’ha observat in vitro. En el cas que s’estigui tractant una embarassada, no és recomanable l’ús de gentamicina per possibles efectes teratogènics.[8][25]
En el cas que el pacient fos al·lèrgic als antibiòtics beta-lactàmics, es recomana l’ús de trimetoprim/sulfametoxazole o eritromicina. Aquest últim pot travessar la placenta i passar al líquid amniòtic, tot i que en dosis subterapèutiques. Els experts recomanen fer servir una alternativa diferent en aquests casos. També s’ha emprat vancomicina, linezolid, meropenem i rifampicina. Es coneixen pocs aïllats resistents a aquests antibiòtics.[8][25]
L. monocytogenes és resistent de forma intrínseca a l’àcid nalidíxic (CMI>128 mg/l) i mostra una susceptibilitat reduïda davant algunes fluoroquinolones importants, com ara ciprofloxacin. Les susceptibilitats del bacteri no han patit canvis considerables que s’hagin pogut demostrar in vitro en els últims 35 anys.[25]
En general, es recomana que la duració del tractament sigui almenys de 14 dies, tot i que passat aquest temps s’han descrit recaigudes en pacients immunodeprimits tractats amb penicil·lina, de manera que caldria allargar-lo en aquests casos.[8][25]
No hi ha disponible una vacuna per la immunització contra la listeriosi. No obstant això, als individus asimptomàtics amb un risc elevat de patir la infecció degut a la ingesta d'un aliment implicat en un brot, se'ls pot administrar ampicil·lina o trimetoprim/sulfametoxazole durant 7 dies com a prevenció. En termes generals, caldria evitar el consum de carn i peix crus o poc cuinats, especialment en el cas d'embarassades.[25]
El diagnòstic ràpid i el tractament antibiòtic augmenten la probabilitat d'una evolució favorable. És imprescindible la identificació de les estratègies més eficients per l'avaluació de riscos des de la producció dels aliments fins al moment del seu consum. En molts països no és una infecció de declaració obligatòria, fet que podria esbiaixar els resultats per la incidència, que podria ser major del que es coneix.[8]
L. monocytogenes es troba distribuïda de forma ubiqua i es pot trobar contaminant molts aliments però els aliments més afectats en els brots i en els casos esporàdics de listeriosi són els aliments a punt per consumir (RTE=ready-to-eat). Com:[26][13]
Tot i això, durant l'elaboració d'aliments pot arribar a contaminar qualsevol aliment per diverses vies: contacte amb femtes, contaminació creuada, etc.[26]
El més important és saber si un determinat aliment suporta el seu creixement, cosa que ha demostrat ser molt complicat de determinar, doncs depèn de molts factors que no estan ben descrits. Alguns exemples d'aquests factors són; la soca, les condicions de preservació del aliment, si aquest ha estat tallat o perforat, si te diverses fases que puguin afavorir l'aparició de nous nínxols ecològics, entre d'altres.[13]
Un exemple del darrer cas, seria el brot alimentari que devia el seu origen a pomes dolces, doncs ni el carmel que les recobria ni aquesta fruita són ambients que suportin el creixement de L. monocytogenes. Es creu que la combinació d'ambdós aliments, juntament amb el pal que perfora la fruita, pot donar lloc a un nou microambient que sí suporti el creixement d'aquest patogen.[13]
Aquest darrer cas posa en manifest la complexitat d'aquest microorganisme i la gran dificultat que presenta a l'hora d'establir criteris microbiològics en aliments de consum humà o animal.[13]
Inicialment, el 23 de setembre de 1999 el Comitè científic sobre mesures veterinàries relatives a la salut pública (SCVPH) va establir dos límits microbiològics per als RTE que determinaven absència en 25 grams per a aquells aliments on L. monocytogenes rarament creix o que han patit un tractament listericida i 100 ufc/g en aliments sense tractament o on el bacteri sí que pot créixer.[27]
Al 2000, a Espanya, es va generar un reial decret, RD 3484/2000, on s'estableixen normes d'higiene per a l'elaboració, distribució i comerç de menjar preparat. Paral·lelament es generen directives europees que entre el 2002-2004 es van unificar generant un reglament únic (CE 178/2002) que harmonitzen, combinen i simplifiquen les exigències d'higiene abans detallades en les directives que cobrien la higiene dels productes alimentaris, especialment els d'origen animal.[27]
I al 2005 s'estableix una normativa europea (CE 2073/2005) que estableix els criteris microbiològics següent:[27]
Criteris microbiològics per a L. monocytogenes establert en el reglament de la normativa europea CE 2073/2005 Categoria del producte pla de mostreig límits Fase en la que s'aplica el criteri n c Aliments RTE destinats a lactants i usos mèdics 10 0 Absència en 25 grams Productes comercialitzats durant la seva vida útil. Aliments RTE que poden afavorir el creixement del microorganisme no destinats ni a lactants ni usos mèdics 5 0 100 ufc/grams d'aliment Productes comercialitzats durant la seva vida útil. 5 0 Absència en 25 grams d'aliment Abans que l'aliment hagi deixat el control immediat de la empresa que el produeix. Aliments RTE que no afavoreixen el creixement del microorganisme 5 0 100 ufc/grams d'aliment Productes comercialitzats durant la seva vida útil.n: nombre de mostres a agafar d'un lot; c: nombre màxim de mostres acceptades amb resultat no satisfactori (superen el límit).
Hi ha hagut un gran debat internacionalment sobre com s'ha de regular la presència d'aquest microorganisme. En el cas de la UE i Canadà s'estableix que en aquells aliments que han donat casos de listeriosi són regulats de forma més estricta (absència en 25 grams) que els aliments que no han donat casos de listeriosi (100 ufc/grams). En canvi, en els EEUU i Regne Unit mantenien criteris de tolerància 0 (absència en 25 grams) perquè que no es pot córrer cap risc de fixar un límit si la dosi infectiva es desconeguda. Tot i això, per petició popular, adscrita per 15 associacions, la FDA va adoptar el límit de 100 ufc/grams en els aliments que no permetien el creixement del microorganisme l'any 2008.[27]
El mètode de referència per a Listeria monocytogenes es troba explicat en la ISO 11290 on trobem mètodes de presència/absència i mètodes de recompte. Es portaran a terme mètodes de recompte o de presència/absència en funció del criteri que s'apliqui. És a dir, per exemple, en el cas de productes destinats a usos mèdics o lactants, el criteri ens indica que el límit és absència en 25 grams, i per tant, s'aplicaran mètodes de presència/absència. Mentre que en el cas de RTE que no afavoreixen el creixement del microorganisme, el límit microbiològic és de 100 ufc/gram s'aplicaran mètodes de recompte.[28]
S'agafen 25 grams de mostra i s'afegeixen en una bossa d'Stomacher que conté 9 vegades més el volum o pes de la mostra de Brou Half Fraser. Tot el contingut s'homogeneïtza de 3 segons a 3 minuts en l'Stomacher i es deixa incubant a 30 ± {displaystyle pm } 
En les plaques de ALOA Listeria monocytogenes forma colònies blaves-verdoses amb un halo opac a les 24 hores, en contraposició amb una altra espècie de Listeria molt semblant que és Listeria ivanovii que presenta l'halo a les 48 hores. En el cas de les plaques Agar Oxford les colònies són de color gris envoltades per un halo negre a les 24 hores i a les 48 hores es tornen negres, a vegades amb un color verd brillant, són més grans i tenen un halo negre amb el centre de la colònia enfonsat. El primer medi conté, entre altres, un compost cromogènic que es degradat per la beta-glucosidasa (present en Listeria monocytogenes) i fosfatidilinositol degradat per la fosfolipasa C (present en el microorganisme). El segon medi conté esculina que en presència d’ions Fe3+ forma un compost fenòlic de color negre.[28][32][33][34][35]
Per confirmar que aquestes colònies són realment Listeria monocytogenes es ressembren 5 colònies en Agar sang de cavall (Horse blood agar). També proposen confirmacions opcionals com: API Listeria, PCR, Test cAMP, etc. Com que Listeria monocytogenes és molt semblant a Listeria ivanovii es poden fer ressembres en medi ALOA de confirmació.[28][32][33][34][35]
Es prepara un homogeneïtzat com en el cas anterior però en aigua de peptona (BPW) o diluent salí de peptona (PSD) i s'homogeneïtza en l’Stomacher entre 30 segons i 3 minuts. Es prepara la dilució 10-1 i altres dilucions, si es necessari, en PSD i es sembren en superfície una o dues plaques de medi ALOA. Si el nombre esperat és molt elevat es pot utilitzar el sembrador de plaques en espiral. Les plaques s’incuben a 37ºC durant 48 hores, tot i que s’examinen a les 24 hores i després a les 24 hores següents.[28][32][33][34][35]
Es subcultiven 5 colònies presumptives en Agar sang de cavall i també, com a confirmació opcional, es poden usar galeries API o PCR.[28][32][33][34][35]
Finalment es calculen les ufc/g o ml que tenim. Es important remarcar que el nombre màxim de colònies per placa no ha de ser major a 150 (en el cas de la sembra en superfície), mentre que en el cas de sembra en espiral un mínim de 20 colònies per cada segment.[28][32][33][34][35]
La listèria monocitògena (Listeria monocytogenes) és un bacteri firmicut estès a tota mena d'ambients (sòl, aigües o microbiota fecal de diversos mamífers) com a sapròfit, però també és capaç de fer la transició a patogen intracel·lular quan és ingerit per humans i animals, jugant un paper com a patogen oportunista.
És l'agent causant de la listeriosi i es considera un dels patògens d'origen alimentari més virulents, amb una letalitat del 20-30%. Responsable d'aproximadament 2.500 casos i 500 morts registrats cada any als Estats Units, la listeriosi és la primera causa de mort entre els patògens dels aliments, superant fins i tot salmonel·la i botulisme.
L. monocytogenes és un bacteri grampositiu, de forma bacil·lar, no formador d'espores, catalasa positiu, oxidasa negatiu, anaerobi facultatiu i productor d'una β-hemolisina (degradació total de l'Agar sang). Quan l'organisme creix entre 20-25ºC produeix i assembla flagels a la superfície cel·lular, en canvi a 37ºC la producció baixa notablement.
